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真武湯配方顆?;瘜W成分研究2020-04-21

真武湯配方顆?;瘜W成分研究
真武湯出自《傷寒論》,藥物組成為:茯苓三錢9g芍藥三錢9g白術二錢6g生姜三錢9g附子炮去皮
,一枚,破八片9g。具有溫陽利水的功效,主治脾腎陽虛,水氣內停證。小便不利,四肢沉重疼痛,
腹痛下利,或肢體浮腫,苔白不渴,脈沉;太陽病發汗過多,陽虛水泛。汗出不解,其人仍發熱,
心下悸,頭眩,身瞤動,振振欲擗地。過量服用會有毒性反應,臨床中偶有口干、便結,孕婦忌服。
本次實驗以高效液相色譜法,對真武湯配方顆粒中的有效成分進行定性然后定量。本實驗旨在為
真武湯配方顆粒的質量標準建立提供參考。
 
1. 材料
1.1儀器+輔助工具
    waters 2695型HPLC儀,包括2966二極管陣列檢測器、Empower3色譜工作站;賽多利斯萬分之
一天平(賽多利斯科學儀器有限公司);0.45μm濾頭,注射器(匹配0.45μm濾頭),500ml燒杯,
玻璃攪拌棒,容量瓶。
1.2藥品與試劑
    對照品:5-羥甲基糠醛,沒食子酸,芍藥內酯苷,芍藥苷,苯甲酸,苯甲酰新烏頭原堿,苯甲酰
烏頭原堿,6-姜酚,白術內酯III,均購買于成都埃法生物科技有限公司,采用面積歸一化法檢測純
度均大于98%。乙腈為色譜純,三乙胺,磷酸,均為分析純,水為怡寶純凈水(4.5L)。
 1.3原料
一方制藥-中藥配方顆粒一劑包括:生姜3包(0.5g/包),茯苓1包(0.5g/包),麩炒白術1包
(3.0g/包),白芍1包(1.0g/包),淡附片配方顆粒(0.7g/包)。(相當于臨床使用藥材生姜9g,
茯苓10g,麩炒白術10g,白芍10g,淡附片6g)
 
2. 方法與結果
2.1色譜條件
色譜柱:月旭C18色譜柱 4.5mm*250mm*5μm;流動相:A:乙腈,B:0.1%磷酸水+0.1%三乙胺水,
(梯度洗脫:0-5min,A:5%,5-25min,A:5%-17%,25-70min,A:17%-65%,70-75min,
A:65%,75-76min,A:65%-90%,76-90min,A:90%,90-92min,A:90%-5%,92-100min,A:5%)。
檢測波長(定量用波長):5-羥甲基糠醛,沒食子酸,6-姜酚均用280nm;芍藥苷,芍藥內酯苷,苯甲酸,
苯甲酰新烏頭堿,苯甲酰烏頭原堿,均用230nm;白術內酯III用222nm。柱溫:35℃,流速:1.0mlmin。
 
2.2真武湯的制備
  取真武湯配方顆粒一劑,500ml燒杯一個,將一劑藥中每個小袋撕開倒入燒杯中,先加50ml沸水濕潤,
再加200ml沸水攪拌使顆粒溶化,放冷,過00.45μm針頭濾器,即得。
 
 2.3溶液配制
分別取,對照品沒食子酸,5-羥甲基糠醛,芍藥內酯苷,芍藥苷,苯甲酸,苯甲酰新烏頭原堿,苯甲酰烏頭原堿,
6-姜酚,白術內酯III(均購買于成都埃法生物),配制成濃度分別為0.14μg/μl, 0.044μg/μl, 0.056μg/μl
,0.164μg/μl,0.032μg/μl,0.012μg/μl, 0.002μg/μl,0.036μg/μl,0.00096μg/μl的混合對照液。
 
2.4系統適用性試驗
精密量取“2.3”項下混合對照品溶液適量,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,
記錄色譜圖。由圖1可知,在該色譜條件下, 各成分均能達到基線分離。


標記時間的峰依次分別為:沒食子酸,5-羥甲基糠醛,芍藥內酯苷,芍藥苷,苯甲酸,苯甲酰新烏頭原堿,苯甲酰烏頭原堿,6-姜酚,
白術內酯III)
2.5標準曲線繪制
 
沒食子酸:Y=446763x-77438   (R=1,n=5)
5-羥甲基糠醛:Y=291453x-64474  (R=1,n=5)
 
芍藥內酯苷:Y=82741x-12477  (R=0.9997,n=5)
 
芍藥苷:Y=306544x-474523  (R=0.999,n=5)
 
苯甲酸:Y=230965x-83997  (R=1,n=5)
 
苯甲酰新烏頭原堿:Y=35628x-493.81(R=0.9998,n=5)
 
苯甲酰烏頭原堿:Y=4611.4x+1409  (R=0.999,n=5)
 
6-姜酚:Y=24491x-5201.6 (R=0.9999,n=5)
 
白術內酯III :Y=2148x+2907.1 (R=0.9994,n=5)
2.6重復性試驗
9種物質保留時間RSD, n=5,
沒食子酸RSD=1.84%,5-羥甲基糠醛RSD=1.40%,芍藥內酯苷RSD=0.36%,芍藥苷RSD=0.29%,苯甲酸RSD=0.22%,
苯甲酰新烏頭原堿RSD=0.09%,苯甲酰烏頭原堿RSD=0.09%,6-姜酚RSD=0.07%,白術內酯IIIRSD=0.05%,表明儀器重現性良好。
2.7樣品含量計算
  標準方程 相關度 真武湯進樣 100μl 峰面積 計算X(體積 μL) 進樣濃度(μg/μl) 進樣質量μg 含量 μg/ml
沒食子酸    Y=446763x-77438 1 14353017 32.3 0.14 4.522 45.22
5-羥甲基糠醛     Y=291453x-64474 1 4827751 16.79 0.044 0.739 7.39
芍藥內酯苷       Y=82741x-12477 0.9997 9925475 120.11 0.056 6.726 67.26
芍藥苷           Y=306544x-474523 0.999 31523969 104.38 0.164 17.118 171.18
苯甲酸           Y=230965x-83997 1 6243645 27.4 0.032 0.877 8.77
苯甲酰新烏頭原堿230 Y=35628x-493.81 0.9998 969149 26.47 0.012 0.318 3.18
苯甲酰烏頭原堿  230 Y=4611.4x+1409 0.999 704830 152.54 0.002 0.305 3.05
6-姜酚           Y=24491x-5201.6 0.9999 88901 3.84 0.036 0.138 1.38
白術內酯III        Y=2148x+2907.1 0.9994 88769 39.97 0.00096 0.038 0.38

3討論
有研究認為,同時測定中藥復方中多個成分時,因 各成分的紫外最大吸收波長不同,因此需要采用波長切
換法測定各成分的含量。參考文獻在 190~400 nm 波長范圍內對 9 種待測成分進行全波長掃描,結果發現,
在233 nm波長處芍藥苷,芍藥內酯苷,苯甲酸,苯甲酰烏頭原堿,苯甲酰新烏頭原堿,有較大吸收,
222 nm波長處白術內酯III有最大吸收,280nm波長處5- 羥甲基糠醛,,有最大吸收,205nm,
272nm處沒食子酸有最大吸收,200nm,281nm處6-姜酚有最大吸收,考慮到部分成分含量較低,
因此在保證各待測成分檢測靈敏度及基線分離的情況下,本研究采用“2.1”項下波長作為檢測波長。
綜上所述,本研究所建定性(保留時間+紫外光譜比對)定量方法準確、專屬性好,可用于同時測定
真武湯中9種活性成分的含量。
附 標準曲線圖+紫外光譜圖








 

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